液相色譜儀憑借高效分離、精準(zhǔn)分析的優(yōu)勢(shì)，已成為教學(xué)科研、制藥生產(chǎn)、環(huán)保監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)及生物工程等領(lǐng)域的核心設(shè)備。正確操作儀器不僅能保障分析結(jié)果的可靠性，更能延長(zhǎng)設(shè)備使用壽命。本文將詳細(xì)介紹液相色譜儀的完整操作流程，并針對(duì)實(shí)際應(yīng)用中常見的問題提供解決方案，為相關(guān)從業(yè)者提供實(shí)用參考。

一、液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作流程

（一）流動(dòng)相準(zhǔn)備

流動(dòng)相的純度與處理質(zhì)量直接影響分析結(jié)果。需根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制所需流動(dòng)相，例如常用的甲醇 - 水混合液（如體積比 8:2），同時(shí)準(zhǔn)備足量純甲醇。所有溶劑均需通過 0.45μm 或 0.22μm 濾膜過濾，去除微小顆粒物；之后進(jìn)行超聲處理，徹底脫除溶解在溶劑中的氣體，避免后續(xù)操作中出現(xiàn)管路堵塞或基線異常。

（二）開機(jī)與系統(tǒng)準(zhǔn)備

打開泵電源，首先確定并設(shè)置好儀器壓力上限，如普通HPLC通常設(shè)定為壓力上限為40MPa，，若已完成設(shè)定可直接進(jìn)入下一步。

將泵的過濾頭放入純甲醇中，設(shè)置流速為 1ml/min，啟動(dòng)泵沖洗系統(tǒng) 10-20 分鐘，完成后停止泵運(yùn)行。

把過濾頭轉(zhuǎn)移至已配制好的目標(biāo)流動(dòng)相中，重新啟動(dòng)泵，讓流動(dòng)相在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)。

打開檢測(cè)器電源，根據(jù)檢測(cè)需求設(shè)定波長(zhǎng)（如檢測(cè)有機(jī)物常用 280nm），按下 “調(diào)零” 鍵完成基線校準(zhǔn)，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

（三）工作站啟動(dòng)與基線監(jiān)控

啟動(dòng)色譜工作站后，留意界面是否出現(xiàn)儀器與工作站連接成功的信號(hào)。持續(xù)觀察基線變化，待基線平穩(wěn)無(wú)明顯波動(dòng)后，說明系統(tǒng)已達(dá)到進(jìn)樣條件。。

（四）進(jìn)樣操作

進(jìn)樣前再次確認(rèn)基線處于正常顯示范圍，若超出范圍需重新進(jìn)行調(diào)零。

將進(jìn)樣閥設(shè)置在“LOAD”（上樣）位置，用微量進(jìn)樣針注入標(biāo)樣或樣品，隨后迅速將進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)至“INJECT”（進(jìn)樣）位置，工作站會(huì)自動(dòng)開始采集數(shù)據(jù)。

待所有色譜峰完全出現(xiàn)在圖譜上后，點(diǎn)擊工作站中的“停止”按鈕，結(jié)束本次數(shù)據(jù)采集。

（五）校正曲線建立（定量分析專用）

設(shè)置定量參數(shù)：點(diǎn)擊工作站中的 “定量參數(shù)” 選項(xiàng)，選擇 “峰面積” 作為定量方式，“外標(biāo)法” 作為定量方法，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)設(shè)為 “1 點(diǎn)”，次方設(shè)為 “1”，同時(shí)明確濃度單位與結(jié)果單位。

填寫組份表：進(jìn)入 “組份表” 界面，輸入待測(cè)組份名稱（如檢測(cè)食品中的辣椒素）、預(yù)期保留時(shí)間（如 5.2 分鐘）及標(biāo)準(zhǔn)濃度（如 100μg/mL）。

生成校正曲線：點(diǎn)擊 “校正曲線” 功能，為每個(gè)標(biāo)樣點(diǎn)選擇對(duì)應(yīng)的譜圖文件，點(diǎn)擊 “重校正” 生成曲線，確認(rèn)曲線線性合格后保存設(shè)置，用于后續(xù)樣品定量計(jì)算。

（六）樣品分析與數(shù)據(jù)查看

對(duì)待測(cè)樣品重復(fù)進(jìn)樣操作，待色譜峰全部出完后停止數(shù)據(jù)采集。點(diǎn)擊工作站中的 “屏幕報(bào)告”，即可查看樣品中目標(biāo)組份的含量等分析結(jié)果；若需分析多個(gè)樣品，可按相同步驟依次操作。

若需回顧歷史數(shù)據(jù)，可進(jìn)入 “再處理” 界面，通過 “打開數(shù)據(jù)文件” 選擇對(duì)應(yīng)樣品的譜圖，點(diǎn)擊 “重新計(jì)算” 后查看 “屏幕報(bào)告”，即可獲取歷史分析結(jié)果。

（七）關(guān)機(jī)與系統(tǒng)維護(hù)

先關(guān)閉檢測(cè)器電源，避免后續(xù)操作中檢測(cè)器受損。

停止泵運(yùn)行，若實(shí)驗(yàn)中使用了含緩沖鹽（如磷酸鹽、醋酸鹽）的流動(dòng)相，需先將過濾頭放入高比例水相（如 90% 水）中，啟動(dòng)泵沖洗系統(tǒng) 30 分鐘以上，徹底清除管路與色譜柱中的鹽分；之后將過濾頭移至純甲醇中，以 1ml/min 流速?zèng)_洗 10-20 分鐘，直至系統(tǒng)壓力穩(wěn)定。

停止泵運(yùn)行，關(guān)閉泵電源，可提前關(guān)閉電腦。

后，用純甲醇或純凈水清洗進(jìn)樣閥，去除殘留樣品，完成整個(gè)關(guān)機(jī)流程。

表 1.液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)操作流程（分階段）

相關(guān)產(chǎn)品推薦：1、高效液相色譜儀  2、超高效液相色譜儀  3、制備液相色譜儀  4、專用液相色譜儀

二、液相色譜儀常見問題解答（Q&A）

Q1：為何流動(dòng)相在使用前必須過濾和超聲？

A1：過濾的核心作用是去除流動(dòng)相中肉眼不可見的微小顆粒物，防止這些雜質(zhì)堵塞色譜柱篩板與管路，影響系統(tǒng)正常運(yùn)行；超聲處理則是為了脫除流動(dòng)中溶解的氧氣、氮?dú)獾葰怏w，避免這些氣體在泵內(nèi)形成氣泡導(dǎo)致壓力波動(dòng)，或在檢測(cè)器中干擾信號(hào)，造成基線噪音增大、出現(xiàn) “鬼峰” 等問題。

Q2：泵啟動(dòng)后壓力異常偏高，可能是什么原因？

A2：主要有四種常見原因：一是色譜柱或管路因雜質(zhì)堆積發(fā)生堵塞；二是流動(dòng)相過濾不徹底，殘留顆粒物在系統(tǒng)內(nèi)累積；三是保護(hù)柱或在線過濾器吸附過多雜質(zhì)，達(dá)到飽和狀態(tài)；四是泵的流速設(shè)置過高，超出系統(tǒng)耐受范圍。排查時(shí)可先斷開色譜柱入口端，啟動(dòng)泵觀察壓力是否下降，以此判斷堵塞位置在柱子還是前段管路。

Q3：泵啟動(dòng)后壓力異常低或無(wú)壓力，該如何處理？

A3：首先需排查三個(gè)關(guān)鍵問題：一是泵內(nèi)是否進(jìn)入大量氣泡，導(dǎo)致無(wú)法正常輸送液體；二是管路接口是否松動(dòng)或損壞，出現(xiàn)漏液情況；三是泵的過濾頭是否被雜質(zhì)堵塞，或色譜柱未正確連接。處理時(shí)可先檢查所有接口密封性，再用純甲醇以較高流速（如 5ml/min）進(jìn)行排液操作，排除泵內(nèi)氣泡。

Q4：基線噪音大、不穩(wěn)定，可能是哪些因素導(dǎo)致的？

A4：常見原因包括五點(diǎn)：一是檢測(cè)池或系統(tǒng)內(nèi)殘留氣泡，可通過提高流速、用異丙醇沖洗檢測(cè)池排除；二是流動(dòng)相混合不均勻，或溶劑純度不足（如含雜質(zhì)），影響信號(hào)穩(wěn)定性；三是檢測(cè)器燈使用時(shí)間過長(zhǎng)，能量衰減或壽命將至，需更換新燈；四是實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)大，或流動(dòng)相溫度與室溫差異明顯；五是色譜柱被污染，柱效下降，需進(jìn)行清洗再生。

Q5：保留時(shí)間不穩(wěn)定（時(shí)快時(shí)慢），該如何解決？

A5：保留時(shí)間漂移多與流動(dòng)相穩(wěn)定性和泵的精度相關(guān)。解決時(shí)需做到三點(diǎn)：一是確保流動(dòng)相按比例準(zhǔn)確配制，且已充分混合均勻，避免因比例偏差導(dǎo)致洗脫能力變化；二是檢查泵的輸液管路是否漏液，漏液會(huì)導(dǎo)致實(shí)際流速低于設(shè)定值，影響保留時(shí)間；三是確認(rèn)色譜柱柱溫箱溫度是否穩(wěn)定，同時(shí)延長(zhǎng)流動(dòng)相平衡時(shí)間（如 30-60 分鐘），確保色譜柱達(dá)到穩(wěn)定工作狀態(tài)。

Q6：色譜峰出現(xiàn)拖尾或分叉，可能是什么問題？

A6：主要與色譜柱性能和樣品處理相關(guān)：一是色譜柱使用時(shí)間過長(zhǎng)，柱效下降，或被強(qiáng)吸附性雜質(zhì)污染，需用專用溶劑（如甲醇 - 水 - 乙腈混合液）清洗再生；二是樣品溶劑與流動(dòng)相極性差異過大（如用純甲醇溶解樣品，流動(dòng)相為低比例有機(jī)相），導(dǎo)致樣品在柱內(nèi)洗脫不均；三是進(jìn)樣量過大，超出色譜柱大負(fù)載能力；四是色譜柱入口篩板破損或內(nèi)部填料塌陷，需更換新柱。

Q7：圖譜中出現(xiàn) “鬼峰”（未知峰），該如何排查？

A7：“鬼峰” 來(lái)源主要有四個(gè)方向：一是前一次樣品殘留，需用純甲醇反復(fù)沖洗進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥；二是流動(dòng)相被污染，或樣品瓶、溶劑瓶?jī)?nèi)壁吸附雜質(zhì)，需更換新的流動(dòng)相并清洗容器；三是系統(tǒng)管路或色譜柱內(nèi)的污染物在特定條件下析出，可通過長(zhǎng)時(shí)間沖洗系統(tǒng)去除；四是樣品在放置過程中或儀器內(nèi)發(fā)生降解，生成新物質(zhì)，需優(yōu)化樣品儲(chǔ)存條件或?qū)嶒?yàn)參數(shù)。

Q8：關(guān)機(jī)時(shí)為何要用純甲醇沖洗系統(tǒng)？

A8：核心目的是保護(hù)色譜柱與管路。若系統(tǒng)內(nèi)殘留緩沖鹽，直接接觸純甲醇等有機(jī)相時(shí)，鹽分會(huì)因溶解度驟降而析出，形成固體顆粒堵塞色譜柱篩板與管路，嚴(yán)重時(shí)會(huì)損壞色譜柱；用純甲醇沖洗后，可將系統(tǒng)內(nèi)的有機(jī)相置換為甲醇，既能防止微生物在管路內(nèi)滋生，又能保持色譜柱填料活性，延長(zhǎng)柱子使用壽命。

表 2.常見故障現(xiàn)象與解決方案對(duì)照表

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